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Research Article

Korean Journal of Plant Resources. 1 October 2020. 536-549
https://doi.org/10.7732/kjpr.2020.33.5.536

Status of Molecular Biotechnology Research Based on Tissue Culture of Soybean

콩 조직배양 기술에 기반한 생명공학 연구 동향
Mi-Suk Seo1
,
Chuloh Cho2
,
Man-Soo Choi1
,
Jae Buhm Chun1
,
Mina Jin3
,
Dool-Yi Kim1*
서 미숙1
,
조 철오2
,
최 만수1
,
전 재범1
,
진 민아3
,
김 둘이1*
1Researcher, Crop Foundation Research Division, National Institute of Crop Science, Wanju 55365, Korea
2Post-doc, Crop Foundation Research Division, National Institute of Crop Science, Wanju 55365, Korea
3Senior Researcher, Crop Foundation Research Division, National Institute of Crop Science, Wanju 55365, Korea
1국립식량과학원 작물기초기반과, 농업연구사
2국립식량과학원 작물기초기반과, 박사후연구원
3국립식량과학원 작물기초기반과, 농업연구관
* Corresponding Author
License (open-access):

© 2020 The Plant Resources Society of Korea, This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

ABSTRACT

Soybean (Glycine max (L.) Merrill) is one of the most important crops of the world. With the completion of the soybean genome sequence, the Korean soybean core collection consisted of 430 accessions with genetic and phenotypic diversity was constructed in recent year. The availability of genome sequences and core collection will result in the crop improvement by molecular breeding using the various accessions and genome editing approaches. Efficient tissue culture techniques, such as haploid production, protoplast culture and plant regeneration from various organs are essential for the successful molecular biological approach and crop improvement. However, soybean is still considered to be recalcitrant in tissue culture because of the low frequency of regeneration and limitation of available responsive cultivars. In this study, we discuss the recent studies of tissue culture technology and methodology for efficient tissue culture to genetic improvement and application of molecular biotechnology in soybean.

Keywords
Core-collection
Genome
Molecular biotechnology
Soybean
Tissue culture

MAIN

  • 서 언

  • 본 론

  •   콩의 반수체 배양

  •   콩의 원형질 분리 및 원형질체 배양

  •   콩 조직으로부터 식물체 재분화

  •   식물 조직배양 관련 유전자

  •   조직배양을 기반으로 하는 콩 형질전환

  • 적 요

서 언

차세대 염기서열 분석기술(Next Generation Sequencing, NGS)의 발전은 식물의 유전체, 유전학 연구를 비롯하여 최근에는 유전체 교정(Genome Editing, GE)을 통한 기능 연구에 이르기까지 기초 및 응용연구 전반에 걸쳐 비약적인 기술의 진보를 가져오게 되었다(Nguyen et al., 2019). 최근에는 식물의 특성을 체계적으로 관찰하고 대량으로 분석할 수 있는 식물표현체 시스템이 구축되면서 유전체 정보와 연계한 농업형질 관련 대량 분자표지 마커 및 유전자 발굴 등의 연구가 가능하게 되었다(Bezouw et al., 2019).

식물의 세포나 조직을 기내에서 배양하여 그 조직이나 기관을 증식시키는 조직배양 기술은 유전자원의 보존, 무병묘 생산, 세포 대량증식과 같은 분야뿐만 아니라 유전적으로 동일한 개체를 획득할 수 있는 반수체 배양, 이형 세포 융합을 위한 원형질체 배양 및 유전자의 형질전환 기법 등과 같은 식물 생명공학 분야에서도 다양하게 활용되고 있다(Buter et al., 1993; Flores et al., 2008; Uchimiya et al., 1986). 이와 더불어 NGS 기술을 통한 식물 표준유전체 해독, 비교유전체 및 구조유전체 분석 연구의 가속화와 함께 유전체 해독을 위한 재료가 되는 식물의 순계를 확보하는 것이 이들 연구의 빠른 성공을 위한 중요한 요소로 주목받고 있으며, 순계확보를 위하여 반수체 배양 기법이 활용되고 있다(Neale et al., 2014). 또한, 식물에 GE 기술을 적용하여 새로운 특성을 가진 작물을 개발하기 위해서는 조직배양 기술을 이용한 원형질체 배양, 식물 형질전환 기술이 필수적으로 고려되고 있다(Eck, 2018). 따라서 유전체를 기반으로 하는 다양한 기초 연구 및 이를 활용한 식물 육종 연구의 성공을 위해서는 효율적인 식물 조직배양 기술이 필수적이다. 식물 조직배양 기술의 중요성이 부각되고 있음에도 불구하고, 벼를 비롯한 몇몇 작물을 제외한 대부분의 식물에서 효율적인 조직배양 기술은 여전히 어려운 문제로 남아있다(Hansen and Wright, 1999). 조직배양 효율이 높은 벼의 경우에도, 일부 품종에 한정되어 조직배양이 이루어지고 있으며, 인디카 품종에서는 낮은 식물 재분화 효율을 보이고 있다(Sahoo et al., 2011). 또한 옥수수와 밀에서도 낮은 조직배양 효율을 극복하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다(He and Lazzeri, 2001; Rakshit et al., 2009).

전세계적으로 널리 재배되고 있는 콩(Glycine max (L.) Merrill)은 장미목 콩과 식물로서 종자에 약 40%의 단백질을 포함하고 있으며, 약 20%는 오일로 구성된 고단백 유지 작물로 경제적 가치가 높다(Vagadia et al., 2017). 식품 원료 외에도 공업용, 사료용 및 녹비용 등 다양한 용도로 이용되고 있다(Singh and Hymowitz, 1999). 현재 콩의 조직배양 연구는 반수체 및 원형질체 배양을 통한 식물체 재분화 효율이 매우 낮고, 식물체 재분화를 통한 형질전환 기술은 일부 품종에 국한되어 있다(Dhir et al., 1992; Hai et al., 2016; Sato et al., 2004). 2010년에 콩의 표준 유전체 정보가 해독(Schmutz et al., 2010)된 이후, 최근에는 표준 유전체 정보를 기반으로 한국, 일본, 중국에서 재배되고 있는 콩 2,872 계통으로부터 유전적, 표현형적으로 다양성을 가진 핵심 집단 430계통이 선발되었다(Chun et al., 2019; Jeong et al., 2019). 콩 핵심집단은 백립중, 개화기 등 농업적으로 중요한 형질을 가진 계통들을 포함하고 있어, 향후 핵심집단을 이용한 콩의 유전 및 육종 연구의 활용이 기대되고 있다. 따라서, 핵심집단을 포함한 다양한 콩 유전자원의 학문적, 산업적 활용도를 높이기 위해서는 효율적인 식물 조직배양 기술이 수반되어야 할 것이다.

본 논문에서는 콩의 유전체 기반 분자육종 연구 및 유전자교정을 비롯하여 형질전환 기술을 이용한 새로운 육종 소재 개발에 선결조건이라고 할 수 있는 콩의 조직배양 연구 현황과 조직배양 효율에 영향을 미치는 요인들에 대하여 서술하고자 한다.

본 론

콩의 반수체 배양

유성생식에 의해 종자를 생산하는 식물은 수분과 수정의 과정을 통해 접합체를 형성하고 세포분열 등의 과정을 거치면서 종자로 발달하여 다음 세대의 개체를 형성하게 된다. 그러나, 이러한 생식 생장 과정 없이 난핵 또는 웅핵이 단독으로 세포분열하여 배를 형성할 수 있는데 이때 형성된 식물체의 경우 정상 식물체의 반수에 해당하는 염색체만 가지고 있는 반수체(haploid)를 형성하게 된다(Seo et al., 2015). 반수체 식물은 자연 상태에서는 극히 낮은 빈도로 나타나는데, 기내 조직배양 기술을 이용하여 반수체를 생성할 수 있게 하는 방법이 다양한 식물에서 시도되었다(Seo et al., 2014; Touraev et al., 1996). 일반적으로 교배 육종을 통해 형질이 고정된 계통을 육성하기 위해서는 최소 5년 이상의 많은 시간과 노력이 소요되는 반면에, 반수체를 이용한 육종은 손쉽게 염색체를 배가시켜 동형접합체(homozygote)를 만들어 낼 수 있기 때문에 유전적으로 고정된 계통을 빠르게 획득할 수 있다. 또한 반수체는 배수성이 다른 종간 교잡에 활용되거나 이배체(diploid)에서 발현되지 않는 우량 열성 형질의 표현형을 선발하기 위해 활용되기도 한다(Lhee et al., 1997). 최근에는, 반복서열(repeat), 염색체의 배수화, 이형접합성(heterozygosity)과 같은 복잡한 식물의 구조 유전체 해독을 위하여 반수체를 이용한 순계 재료 확보의 중요성이 더욱 주목받고 있다(Velasco et al., 2010). 반수체를 유도하는 방법에는 웅성 배우체인 약(anther)과 소포자(microspore), 혹은 자성 배우체 기관인 배주(ovule)를 이용하는 방법이 널리 사용되고 있다(Ferrie and Keller, 1995; Zhang et al., 1992). 특히 자가불화합성을 가진 배추속 작물을 중심으로 소포자 혹은 약을 이용한 반수체 유도 연구가 활발하게 진행(Bajaj et al., 1986; Keller and Armstrong, 1983)되고 있으며, 자가수정 작물인 벼, 보리, 밀 등에서도 육종 연한의 단축, 순계 획득 등을 위한 반수체 연구가 진행되고 있다(Cistué et al., 2006; Jacquard et al., 2009; Ochatt et al., 2009). 약배양은 화기의 수술대에 달린 웅성배우체인 약이 화분으로 완전하게 발달하기 전 단계에서 기내배양을 통하여 웅성 반수체를 유도하는 방법으로 콩을 비롯하여 밀, 옥수수 등과 같은 작물에서 약배양을 통한 반수체 생산 연구가 진행되었다(Buter et al., 1993; Guiderdoni et al., 1992; Wheatley et al., 1986). 콩에서는 1970년대부터 다양한 품종을 대상으로 약배양을 통한 반수체 생산 연구(Ivers et al., 1974)가 진행되었으나 아직까지 효율적이고 안정적인 반수체 생산에 관한 연구 결과는 보고되지 않고 있다(Table 1). Zao et al. (1998)은 콩 110 계통을 약배양하여 28 계통에서 배발생을 유도하였으나 식물체 재분화율은 2% 미만이라고 보고하였다. 성공적인 약배양을 위해서는 식물의 유전형, 약 분리 시기 및 배양 배지의 조성 등이 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Farnham, 1998; Phippen and Ockendon, 1990). 화분으로 완전하게 발달하기 전의 약을 기내배양하여 웅성 반수체를 유도하는 약배양은 약을 분리하는 시기가 매우 중요한 것으로 알려져 있는데, Hai et al. (2016)은 4 계통의 콩을 대상으로 약의 채취 시기 및 배양 배지 조건에 따른 약배양 효율을 조사한 결과, 1핵기의 소포자를 함유하는 2.3 ~ 4 ㎜ 크기의 약배양시, 가장 높은 캘러스 유도율과 재분화율을 관찰할 수 있었고, 효율적인 캘러스 유도와 재분화를 위하여 품종에 따라 배양 배지의 호르몬 조합이 영향을 주는 것으로 보고되었다. 콩에서 농업적 활용도가 높은 계통을 대상으로 효과적인 반수체 생산 체계가 구축된다면, 콩의 유전체 기반 및 분자육종 연구의 가속화를 통한 다양한 육종 소재 개발이 가능할 것이다. 콩의 성공적인 약배양을 위해서는 다양한 계통에 따른 최적 약 분리시기, 전처리 효과, 배양 환경 및 배지의 조성에 따른 반수체 유도 효율에 관한 연구가 활발히 이루어져야 할 것이다.

Table 1.

Studies for efficient anther culture in soybean

Soybean genotype Reference
Four genotypes (G1, G2, GP451, PK 1347) Hai et al. (2016)
Four cultivars (Bragg, IAS5, MG/BR-46-Conquista, BRS133) Rodrigues et al. (2005)
110 genotypes Zhao et al. (1998)
Brazilian soybean cultivars (IAS5, RS7) Kaltchuk-Santos et al. (1997)
Hark Ivers et al. (1974)

콩의 원형질 분리 및 원형질체 배양

식물세포에서 세포벽을 제거한 세포를 뜻하는 원형질(protoplast)은 유전적인 구조가 서로 다른 두 가지의 세포를 융합하는 원형질체 융합(protoplast fusion)이나 다른 세포의 세포기관이나 유전물질을 이식하여 잡종세포를 만드는 체세포 잡종(somatic hybridization) 기술을 위하여 1970년대부터 본격적으로 연구가 시작되었다(Kao et al., 1970, 1974; Melchers and Labib, 1974). 특히, 배추, 양배추와 같은 배추과, 오렌지, 레몬 등과 같은 감귤류, 그리고 토마토 등의 가지 속에서 원형질체 융합 관련 연구가 활발하게 이루어지고 있다(Collonnier et al., 2003; Guo et al., 2004; Qian et al., 2003). 1980년대부터는 새로운 농업 형질을 식물에 도입하기 위하여 원형질을 이용한 형질전환 연구가 벼를 포함한 다양한 작물에서 시도되었다(Rhodes et al., 1988; Uchimiya et al., 1986; Zhang and Wu, 1988). 원형질체 배양은 물리적 방법, 혹은 cellulase와 pectinase와 같은 효소적 방법을 사용하여 원형질체를 둘러싸고 있는 세포벽을 제거하고 정제한 후 배양하여 세포분열을 통해 식물체로 재분화하는 과정을 거치게 되는데, 다양한 식물종에서 효율적인 원형질체 분리, 배양 및 식물체 재분화 조건을 최적화하였다(Chen et al., 2004; Kakkar et al., 2000; Rhodes et al., 1988). 콩에서는 주로 미성숙 자엽 혹은 배축 부위를 채취하여 원형질을 분리하는 연구가 진행되었고, 미성숙 자엽으로부터 분리된 원형질체는 1.2% agarose bead를 사용하여 배양하였을 때 액체 배양과 비교하여 캘러스 유도율이 증가하였다(Dhir et al., 1991) (Table 2). 또한 glutamine, asparagine 그리고 GA3의 첨가는 캘러스로부터 식물체 재분화의 효율을 증가시킨다고 보고하였다. Dhir et al. (1992)은 14 품종의 미성숙 자엽에서 원형질을 분리하여 Jack 품종에서 27%의 비교적 높은 재분화 효율을 나타내었다. 그러나, 콩에서 원형질체 분리 및 식물체 재분화 효율은 타작물들에 비하여 현저히 낮고, 형질전환된 원형질체로부터 식물체 재분화는 매우 어려운 실정으로 1990년대 이후 콩 원형질체 배양에 관한 연구 결과는 보고되지 않았다. 최근, 원형질체를 이용한 형질전환 기술은 개별세포(single cell)에 목적 유전자를 도입할 수 있고, 유전자 변형 식물체의 환경 위해성 문제를 피해갈 수 있다는 장점 때문에 RNP (ribonucleoprotein)를 기반으로 하는 DNA-free 유전자 교정 연구가 여러 작물에서 시도되고 있다(Lin et al., 2018). 콩에서는 원형질체를 분리하여 유전자 교정 연구를 수행하였으나 아직까지 원형질체로부터 유전자교정된 식물체의 생산은 보고되지 않고 있다(Sun et al., 2015). 콩의 원형질을 이용한 효과적인 형질전환 및 유전자 교정 기술의 개발을 위해서는 원형질체 분리를 위한 효율적인 분리 및 정제 조건, 그리고 캘러스 유도 및 식물체 재분화 등을 포함하는 최적 배양 조건에 대한 지속적인 연구가 수행되어야 할 것이다.

Table 2.

Studies about protoplast isolation and culture in soybean

Explant type Soybean cultivar Reference
Immature cotyledon　 14 soybean genotypes Dhir et al. (1992)
Clark63 and Heilong Dhir et al. (1991)
6 soybean genotypes Wei and Xu (1988)
Wye, Williams 82 Lin et al. (1987)
Seedling hypocotyl 16genotypes (이G. max, G. sojaetc) Gamborg et al. (1983)
Mandarin Klein et al. (1981)
이G. max Hammatt and Davey (1988)
이G. canescens PI399478 Newell and Luu (1985)
Pod Strain T219 Zieg et al. (1980)

콩 조직으로부터 식물체 재분화

식물의 조직을 배양하여 캘러스를 유도하고 식물체를 재분화시키는 기술은 유전자원의 증식 및 활용뿐만 아니라 생명공학 기술을 이용한 유용 유전자의 형질전환을 위해서 반드시 필요한 기술이다. 특히, 농업적으로 유용한 형질을 식물에 도입하여 원하는 형질로 개량하는 식물 형질전환 기술은 벼를 포함한 다양한 작물에서 연구가 진행되고 있으며, 효율적인 식물 형질전환을 위해서는 조직을 배양하여 식물체를 재분화시키는 기술이 선행되어야 할 것이다. 식물체 재분화 효율은 배양 배지의 조성이나 배양환경, 모식물의 유전형 및 절편체 종류 등 다양한 요인의 영향을 받는다(Ge et al., 2006; Seo et al., 2013). 콩에서는 배양 배지에 첨가되는 호르몬의 종류 및 농도를 포함하는 배양 배지 조성의 효과, 절편체 종류 및 유전형에 따른 다양한 조직배양 조건을 검토하여 효율적인 재분화 시스템을 개발하는 연구가 진행되었다(Table 3). 콩의 자엽(cotyledon), 자엽절(cotyledonary node) 및 배축(hypocotyl) 등과 같은 다양한 조직을 배양하여 재분화를 유도하였는데, 자엽절을 사용하여 효율적인 재분화를 유도하는 연구가 주로 이루어지고 있다(Barwale et al., 1986; Raza et al., 2017; Sairam et al., 2003). 또한, 배지에 첨가하는 식물생장조절 물질은 재분화 효율에 크게 영향을 미치는 요인으로 조사되었는데, 콩의 경우 cytokinin 계열의 BAP가 재분화를 위해 가장 효과적으로 사용되고 있으며, 일부 연구에서는 TDZ (thidiazuron)의 첨가에 따른 효과를 보고하였다(Kaneda et al., 1997; Yoshida, 2002). 콩의 재분화 효율은 품종에 따라 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있는데, Raza et al. (2017)은 품종에 따른 절편 부위 및 식물생장조절물질의 농도가 식물 재분화에 미치는 영향에 대하여 보고하였다. 또한 국내에서는 Kim et al. (2016)이 우리나라 콩 재배품종들을 대상으로 조직 절편 부위 및 배지 종류에 따른 재분화 효율을 검토한 바 있다. 이외에도, 배양 배지내 첨가물에 따른 재분화 효율에 관한 연구 결과가 보고되었는데, 최근 Karthik et al. (2019)은 PUSA 9712 품종의 재분화 배지에 식물의 성장과 발달 과정에서 다양한 조절 기능을 가진 것으로 알려진 SNP (sodium nitroprusside)를 첨가하여 증가된 재분화 효율을 확인할 수 있었다. 따라서, 우리나라 콩 유전자원의 증식 및 재배품종의 형질전환을 통한 육종 소재 개발을 위해 높은 재분화 효율을 가진 콩 적합 계통의 선발과 함께, 품종에 따른 절편 부위별, 배양배지의 조성, 첨가물의 효과 등 재분화에 영향을 미치는 다양한 요인들에 대한 활발한 검토가 이루어져야 할 것이다.

Table 3.

Plant regeneration studies in soybean

Explant type Soybean cultivar Shoot regeneration
medium 		Hormone treatment of
shoot regeneration medium 		Reference
Cotyledonary node White hilum MS medium BAP 0.5 ㎎/L Shan et al. (2005)
155 G. max and 13 G. soja B5 medium BAP 1-5 µmol Barwale et al. (1986)
Williams 82, Newton, Loda Modified MS medium BAP 8.8 µM Sairam et al. (2003)
Clark MS medium BAP 1 ㎎/L Shetty et al. (1992)
Wayne MS medium BAP 5 µmol Wright et al. (1986)
Immature cotyledons 33 soybean genotypes MS medium + /
B5 vitamins 		- Parrott et al. (1989)
Cotyledonary node and
hypocotyl 		Bonminori MS medium +
B5 vitamins 		TDZ 2 ㎎/L or
BAP 1.15 ㎎/L 		Kaneda et al. (1996)
Cotyledonary node,
hypocotyl and half split
hypocotyl 		Nine cultivars containing
Jack and William 		B5 medium BAP 1.67 ㎎/L Raza et al. (2017)
Young cotyledon Six cultivars MS medium +
B5 vitamins 		BAP 3 ㎎/L,
NAA 0.04 ㎎/L 		Yang et al. (1990)
Embryogenic callus
derived from suspension
culture of cotyledons 		Fayette MS medium +
B5 vitamins 		- Finer and Nagasawa
(1988)
Hypocotyl 　 13 soybean genotypes SI medium modified
MS medium 		BAP 5-10 µmol Dan and Reighceri
(1998)
Ohsuzu, Kosuzu, Suzukari,
Suzuyataka, Tachiyutaka,
NT-98-236 		B5 medium TDZ 2-10 µmol Yoshida (2002)
Immature embryos 26 cultivars (Japan) MS medium +
B5 vitamins 		- Komatsuda and Ohyama
(1988)
Half-seed PUSA 9712 MS medium +
B5 vitamins 		BAP 4.4 µM Karthik et al. (2019)

식물 조직배양 관련 유전자

앞서 언급한 바와 같이 효율적인 식물 조직배양 기술은 조직 절편체의 종류, 배양배지의 조건 및 유전형(genotype) 등과 같은 다양한 요인들에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 특히 식물의 유전형에 따라 조직배양 효율은 크게 영향을 받기 때문에 조직배양에 적합한 계통을 선발하여 배양 효율을 증진시키는 연구가 다양한 식물에서 진행되었다(Bolibok et al., 2007; Ge et al., 2006; Mano and Komatsuda, 2002). 그러나 작물에서 농업적 가치가 높은 대부분의 계통들은 여전히 낮은 조직배양 효율을 가지고 있기 때문에 육종 소재 개발을 위한 연구에 커다란 장애요인이 되고 있다(Taguchi-Shiobara et al., 1997; Yang et al., 2011). 따라서, 식물의 조직배양 효율에 관여하는 메커니즘을 규명하여 농업적 가치가 높은 계통의 조직배양 효율을 개선하고자 하였다(Nishimura et al., 2005; Seo et al., 2013; Taguchi-Shiobara et al., 2006).

식물 조직배양 효율에 관련된 메커니즘 연구는 주로 애기장대와 벼를 중심으로 활발하게 이루어지고 있으며, 최근 콩에서도 조직배양 효율에 관여하는 유전자가 일부 확인되었다. 애기장대에서는 지베렐린 생합성 조절에 관여하는 전사조절인자 LEC1 (LEAFT COTYLEDON1), LEC2 (LEAFT COTYLEDON2)와 FUS3 (FUSCA3) 유전자가 체세포배 발달을 유도하는 유전자로 알려져 있으며, SERK1 (Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase1) 유전자는 정단분열조직에서 체세포배 발달을 증가시키는 유전자로 보고되었다(Gaj et al., 2005; Gazzarrini et al., 2004; Hecht et al., 2001). 벼에서는 재분화 효율에 관여하는 QTL 유전자 NiR (ferredoxin-nitrite reductase)의 동정 및 질소동화 작용의 조절에 의한 재분화 효율 증진의 메커니즘을 규명하였고, NiR 유전자의 형질전환을 통해 재분화 능력이 개선된 형질전환체를 획득하였다(Nishimura et al., 2005). 또한, 식물의 성장과 발달에 관여하는 것으로 알려진 MADs 도메인 전사조절인자군에 속하는 AGL15 (AGAMOUS-LIKE15)와 AGL18 (AGAMOUS-LIKE18)은 애기장대와 콩에서 체세포 배발생에 관여하였다(Thakare et al., 2008; Zheng and Perry, 2014; Zheng et al., 2016)(Table 4). 최근에는 과실의 성숙, 화기 발달 및 내재해 저항성과 같은 다양한 생물학적 기능을 가진 AP2/ERF 전사조절인자에 속하는 GmESR1 (Enhancer of shoot Regeneration 1)과 GmRAV1 (Related to ABI3/VP1 family)이 콩의 재분화 과정에 관여한다고 보고되었다(Zhang et al., 2017, 2018). GmESR1은 콩의 재분화에 관여하는 유전자들을 조절함으로써 종자의 발아와 생장 및 재분화에 영향을 미치며, GmRAV1은 식물호르몬의 일종인 cytokinin 신호전달 경로에 관여하여 콩의 뿌리와 유식물체의 재분화를 유도하였다(Zhang et al., 2017; 2018). 이와 같이, 콩을 비롯한 여러 작물에서 조직배양 효율 관련 유전자의 탐색 및 기능 연구가 수행되고 있으며, 이러한 결과를 바탕으로 조직배양 능력이 우수한 계통 선발을 위한 마커 개발 및 조직배양 효율 관련 메커니즘의 조절을 통한 효율적인 조직배양 기술의 확립이 가능할 것이다.

Table 4.

Genes related to plant tissue culture efficiency in soybean

Gene name Gene description Gene function References
GmESR1
(Enhancer of Shoot Regeneration1) 		Transcription factor targetting
regeneration-associated genes 		Seed germination and shoot and root
elongation 		Zhang et al. (2017)
GmRAV1
(Related to ABI3/VP1 family) 		AP2/ERF transcription factor Regulators of the cytokinin signaling
pathway involved in root and shoot
regeneration 		Zhang et al. (2018)
GmAGL15
(AGAMOUS-LIKE15), GmAGL18
(AGAMOUS-LIKE18) 		MADS box transcription factor Plant regeneration by somatic
embryogenesis 		Thakare et al. (2008),
Zheng and Perry
(2014), Zheng et al. (2016)

조직배양을 기반으로 하는 콩 형질전환

차세대 염기서열 분석(NGS) 기술이 발달하면서 식물의 표준 유전체 정보를 바탕으로 특정 형질 관련 유전자의 탐색 및 분자 표지 개발 연구가 활발하게 진행 중에 있다(Blanca et al., 2012). 특히 식물 염색체에 목적 유전자를 안정적으로 도입하는 형질전환 기술은 유전자의 기능을 규명하고, 새로운 형질을 가진 품종을 개발하기 위한 기술로 다양한 식물에서 안정적인 형질전환 기술 개발 연구가 이루어지고 있다(Hamada et al., 2017; Li et al., 2017). 식물의 형질전환 기술 개발을 위해서는 효율적인 조직배양 시스템 확립이 필수적이지만 옥수수, 밀, 보리 등과 같은 주요 작물에서는 낮은 조직배양 효율로 인해서 안정적인 형질전환 기술 개발이 어려운 실정이다(Ishida et al., 2007; Travella et al., 2004). 조직배양이 까다로운 작물 중 하나로 알려진 콩의 경우, Table 3에서와 같이 다양한 계통 및 배양 조건 개선을 통해 조직배양 효율을 향상시키기 위한 연구들이 꾸준히 시도되었고, 그 결과 Agrobacterium과 Particle bombardment법을 이용하여 다양한 유전자들의 형질전환 연구가 진행되고 있다(Table 5). Agrobacterium 법은 목적 유전자를 Agrobacterium tumefaciens 균주내 T-DNA 벡터에 삽입하여 식물 세포에 도입하는 방법으로, 저비용으로 활용이 용이하며, 도입된 유전자가 안정적으로 후대에서 발현하는 장점을 가지고 있다. 그러나 Agrobacterium내의 T-DNA가 식물세포 내에 도입되기 위한 최적 조건의 탐색 및 도입된 식물세포가 정상적으로 재분화되는 배양계의 확립에 어려움이 많아 적용 가능한 대상 식물이 한정적이다. 콩에서는 자엽절(Hinchee et al., 1988), 미성숙 자엽(Parrott et al., 1994), 그리고 배발생 현탁 배양 세포(Trick and Finer, 1998) 등과 같은 다양한 조직을 사용하여 Agrobacterium에 의한 형질전환이 초기에 시도되었으나 최근에는 주로 자엽절을 이용한 Agrobacterium법이 널리 사용되고 있다(Flores et al., 2008; Eckert et al., 2006). 표준 유전체 해독을 위해 사용된 Williams 82 품종에서는 제초제 저항성(Zeng et al., 2004), zein 단백질 축적 관련 유전자(Kim and Krishnan, 2004)의 Agrobacterium법에 의한 형질전환이 보고된 바 있으며, 이외에도 다양한 품종에서 지방산 및 단백질 함량 관련 유전자와 병저항성 유전자의 형질전환이 보고되었으나 아직까지 Agrobacterium을 이용한 콩의 형질전환 효율은 낮고 형질전환 가능한 품종이 제한적이다(Li et al., 2017; Zhao et al., 2019). 우리나라에서는 주로 광안콩에 한정되어 Agrobacterium법에 의한 형질전환 연구가 진행되고 있다(Kim et al., 2017). 따라서, 새로운 육종 소재 개발을 위해서는 농업적 가치가 높은 국내 콩 품종에서 Agrobacterium을 통한 효율적인 형질전환법의 개발이 이루어져야 할 것이다. Agrobacterium과 비교하여 형질전환을 통한 외래 유전자 도입이 비교적 용이하다고 알려진 particle bombardment법은 목적 유전자를 금입자 혹은 텅스텐 등과 같은 미세 입자로 코팅하여 유전자총(gene gun)을 통하여 목적 유전자를 식물세포에 도입하는 방법으로 형질전환을 시도하고 있다(McCabe and Martinell, 1993; Vasil and Vasil, 2006). 콩에서는 배축(embryonic axis)과 미성숙 자엽에서 유도된 체세포 배를 이용하여 particle bombardment를 사용한 형질전환 연구가 진행되고 있다. 특히 Jack 품종의 미성숙 자엽을 이용하여 제초제 및 병 저항성, 그리고 기능성 물질 함량 관련 유전자 등 다양한 유전자가 도입된 형질전환 식물체가 생산되었다(Table 5). 그러나, particle bombardment를 이용한 형질전환에는 미성숙 자엽의 채취를 위한 재료의 유지에 많은 인력과 시간, 형질전환을 위한 고가의 장비 및 유지 비용이 소요될 뿐만 아니라 물리적 방법에 의해 목적 유전자를 도입하는 과정에서 식물 세포의 손상, 유전자의 다중 도입(multiple copy numbers)에 의한 불안정적인 발현 및 유전자 침묵(gene silencing) 등이 문제점으로 지적되고 있다(Matzke et al., 1994; Wang et al., 2009). 이러한 문제점을 개선하기 위해서는 형질전환에 사용이 용이한 절편 부위의 선발, 물리적 형질전환 방법의 개선 및 저가의 고효율 particle bombardment 장비의 개발 등이 필요할 것이다.

Table 5.

Recent advances for soybean transformation

Transformation
method 		Explant Soybean cultivar Target gene Gene function Reference
Agrobacterium Cotyledonary
node 		Williams 82　 Bar Herbicid resistance Zeng et al. (2004)
11-kDa methionine-rich delta-zein Accumulation of zein
protein 		Kim and Krishnan (2004)
Jack α-linolenic acids (GmFAD3) Reduction of α-linolenic
acids 		Flores et al. (2008)
Thorne,
NE3001, 420-5 		Δ6Δ15desaturase gene Accumulation of
stearidonic acid 		26 Eckert et al. (2006)
Asgrow3237 vegetative storage protein gene (VspA) Reduction of VSPα and
VSPβ 		Staswick et al. (2001)
A3237, Thorne,
NE3001 		Δ6-desaturase gene γ-linolienic acid and
stearidonic acid 		Sato et al. (2004)
Somatic embyo Chapman β-glucuronidase (GUS) - Trick and Finer (1998)
Embryonic tip Hefeng25, 35, 39
etc. 		Pinellia ternata agglutinins gene (pta),
Insecticidal crystal protein gene (crylAc) 		Resistance to cotton
bollworm 		Dang and Wei (2007)
Particle
bombardment 		Embryonic axis BR-16, 91,
Doko RC 		Acetohydroxyacid synthase (ahas) Herbicid resistance Aragão et al. (2000)
BR-16　 Oxalate decarboxylase (oxdc) Resistance to white
mould 		Cunha et al. (2010)
Human growth hormone gene (hgh) Accumulation of mature
form of hGH 		Cunha et al. (2011)
Conquista ER luminal binding protein (BiP) Tolerance to drought
stress 		Valente et al. (2009)
Somatic embyo
derived from
immature
cotyledons 		Jack α-subunit of rice anthranilate synthase (OASA1D) Increase of free
tryptophan 		Kita et al. (2007)
Green fluorescent protein (GFP) - Khalafalla et al. (2005)
Gly m Bd 30K gene Reduction of allergen Herman et al. (2003)
Δ5, Δ6, Δ15 desaturase gene,
GLELO elongase gene 		Production of arachidonic
acid 		Chen et al. (2006)
Epoxygenase gene (SIEPX), Diacylglycerol
acyltransferase genes (VgDGAT1 and VgDGAT2) 		Increase of epoxy fatty
acid 		Li et al. (2010)
Soybean phytase gene (Gmphy) Reduction of phytate
content 		Chiera et al. (2004)
Transcription factor CRC, flavanone
3-hydroxylase gene (F3H) 		Increase of isoflavones Yu et al. (2003)
Chalcone synthase gene (CHS6), Isoflavone
synthase gene (IFS2), Phenylalanine
ammonia-lyase gene (PAL5) 		Reduction of isoflavone Zernova et al. (2009)
β-amyrin synthase gene (GmBAS1) Reduction of seedsaponin Takagi et al. (2011)
Insecticidal crystal protoxin gene (cry1Ab) Resistance to velvetbean
caterpiller 		Dufourmantel et al.
(2005)
Inverted repeat-SbDV coat protein (CP) Resistance to soybean
dwarf virus (SbDV) 		Tougou et al. (2007)
Bacterial 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase
(HPPd) 		Isoxaflutole tolerance
(herbicide) 		Dufourmantel et al.
(2007)
Jack, JQ1, JQ2 α-subunit of rice anthranilate synthase (OASA1D) Increase of free
tryptophan 		Kita et al. (2007)

최근 CRISPR/CAS9과 같은 유전자 가위 기술을 이용하여 목적 유전자를 식물 게놈 상에서 직접적으로 교정하는 연구가 다양한 식물을 대상으로 이루어지고 있다(Jaganathan et al., 2018). 유전자 가위를 통해 목적 유전자를 직접 교정하여 우수한 형질을 식물에 도입하거나, 불필요한 형질을 제거하는 유전자 교정 기술은 GMO를 대체할 수 있는 기술로 주목받고 있으며, 유전자 교정 기술을 통해 새로운 형질을 가진 품종을 개발하기 위한 노력들이 전세계적으로 진행되고 있다(Jaganathan et al., 2018). 유전자 교정 기술을 효과적으로 식물에 적용하기 위해서는 조직배양을 기반으로 하는 효율적인 형질전환 시스템이 선행되어야 한다. 그러나, 콩을 포함한 대다수의 작물에서 조직배양을 기반으로 하는 효율적인 형질전환 시스템은 일부 품종에 한정되어 연구가 진행되고 있다(Zhang et al., 2017). 콩에서는 비교적 형질전환이 용이한 Williams82와 Jack 품종을 중심으로 유전자 교정 연구가 진행되고 있으며, 콩의 개화시기 조절(Cai et al., 2018) 및 식물 구조 형성(Bao et al., 2019)과 같은 생산성 관련 형질, 그리고 카로티노이드 생합성 관련 유전자(Du et al., 2016)등의 교정을 통한 목적 형질의 전환이 보고되었다.

현재까지 콩에서는 약배양 및 원형질체 배양 등을 비롯한 다양한 조직배양 연구가 진행되었으나 아직까지 재분화 효율은 높지 않고 조직배양 효율에 관여하는 메커니즘 규명 및 조직배양 효율 관련 유전자에 대한 연구도 일부에 불과하다. 이와 더불어, 조직배양을 통한 목적 유전자의 형질전환 기술도 일부 계통에 한정적이고, 형질전환 효율 또한 높지 않은 실정이다. 본 논문에서는 현재까지 콩에서 시도된 다양한 기내 조직배양 및 형질전환 연구의 현황을 분석함으로써 향후 농업적 가치가 높은 콩 품종을 이용한 조직배양 기술의 적용을 위한 정보를 제공하고자 하였다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 효율적인 콩 조직배양 시스템이 구축된다면 향후 유전체 육종 및 GE기술을 적용한 콩의 새로운 육종 소재 개발을 통한 가치창출에 기여할 수 있을 것이다.

적 요

콩은 전세계적으로 재배되는 중요한 작물 중에 하나로 최근, 표준유전체 해독과 함께 유전적, 표현형적으로 다양성을 가진 한국핵심집단이 구축됨에 따라 유전체 기반 분자 육종 연구, 유전자 교정 기술을 활용한 새로운 육종 소재 개발 연구가 가속화될 것으로 예상된다. 유전체 정보 기반 작물의 분자 육종 및 생명공학 연구를 통한 성공적인 작물의 개량을 위해서는 식물의 효율적인 조직배양 기술이 수반되어야 할 것이다. 그러나 반수체 생산, 원형질체 배양 및 형질전환 기술과 같은 콩의 조직배양 효율은 아직까지 높지 않고 일부 계통에 한정되어 이루어지고 있다. 본 논문에서는 콩의 분자육종 및 생명공학 기술의 적용을 위하여 다양한 콩 조직배양 기술에 관한 연구 동향을 분석하고 조직배양 효율에 영향을 미치는 요인들에 대한 정보를 제공하고자 하였다.

Acknowledgements

본 연구는 농촌진흥청 국립식량과학원 어젠다 사업(과제번호: PJ014954012020)과 차세대농작물 신육종기술개발사업(과제번호: PJ015157032020)의 지원에 의하여 수행되었습니다.

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