Korean Journal of Plant Resources. April 2019. 124-143
https://doi.org/10.7732/kjpr.2019.32.2.124


ABSTRACT


MAIN

  • 서언

  • 재료 및 방법

  •   자원 선정 및 처리

  •   NIRS 검량식 작성 및 검증

  •   NIRS를 이용한 아밀로스 및 단백질 함량 측정

  •   자원들의 다양성 지수 계산

  •   확률밀도함수 작성

  •   정규분포의 표준화

  •   표준화에 의한 Data 구간 산정

  • 결과 및 고찰

  •   NIRS 검량식 작성 및 검증

  •   벼 유전자원의 집단분석

  •   재래종 자원

  •   육성품종 자원

  •   잡초형 자원

  •   육성계통 자원

  •   자원 정보구축에 관한 고찰

  • 적요

서언

벼는 아시아 지역에서 생산과 소비의 대부분이 이뤄지고 있으며, 중국과 인도는 주요 쌀 생산국으로 전 세계 생산량의 50% 이상을 차지한다(Oh et al., 2016; Peng et al., 2009). 쌀의 식미는 생산과 소비에 영향을 주는 요인이며, 지리적 특성과 소비자의 선호도가 반영되어 벼 육종방향을 결정하는 기준이 된다. 쌀 배유의 약 80%를 차지하는 전분은 아밀로스와 아밀로펙틴으로 이루어져 있으며, 이들 함량 조성비가 식미를 결정하는 주된 요인이다(Kim et al., 2012). 또한 배유의 약 7%를 구성하는 단백질은 함량이 높을수록 밥의 경도가 증가하게 되어 식미 저하가 일어난다(Lee et al., 1996).

근적외선 분광법(NIRS)는 대량의 시료를 복잡한 전처리 과정 없이 다양한 성분을 빠른 시간 내 분석이 가능하다는 장점이 있어 다양한 농작물 품질평가방법에 적용되고 있다(Kim et al., 2008a, 2008b; Song et al., 2006; Kwon et al., 2005, 2006; Kim, 2004). 미국 국제인증기관(AOAC)은 밀 단백질, 육류의 지방, 수분, 단백질 함량 분석법으로 NIRS를 채택하고 있으며, 미국 농무성(USDA)은 밀 단백질 함량과 콩 단백질 및 기름 함량 분석에 공식이용하고 있다. 농축산품의 경우 주요구성 성분인 지방(C-H), 아밀로스(O-H) 및 단백질(N-H, S-H)이 근적외선을 흡수하므로 다양한 성분들의 동시 분석이 가능하다(Clarke et al., 1992; Williams and Norris, 1987; Abrams et al., 1987). 쌀의 식미평가 시스템개발(Kawamura et al., 2003; Wu and Shi, 2007) 및 벼 아밀로스와 단백질 성분의 대량평가를 위한 예측모델개발에 대한 접근이 시도되었다(Kim et al., 2008a, 2008b; Shu et al., 1999; Han et al., 1998; Moon et al., 1994; Delwiche et al., 1996). 벼 아밀로스 및 단백질에 대한 습식분석결과와 근적외선 스펙트럼간의 상관관계를 다변량회귀분석법을 적용하여 해석하고 대량평가에 적용 가능한 NIRS 예측모델을 개발하였다(Oh et al., 2017a).

밀 품질 분석 및 계통선발(Kim et al., 2016), 나무 조직세포의 탄수화물 함량 분석(Ramirez et al., 2015), 현미의 카드뮴 함량 분석(Zhu et al., 2015), 약초의 일종인 황금의 약효성분분석(Kim et al., 2014), 벼 생엽의 질소함량 분석(Song et al., 2013), 사일리지의 품질평가(Cho et al., 2012), 지리적 원산지 콩판별(Ahn and Kim, 2012), 녹차의 카테킨 함량 측정(Chun, 2010), 옥수수 알곡의 단백질, 전분 및 유지함량 측정(Jiang et al., 2007) 등의 연구결과가 보고되었다.

유전자원에 관한 성분 분석 자료는 집단 통계 분석을 통해 군집들 간의 특성을 상호 비교하고 차별 유무를 파악하였다(Oh et al., 2018). 해안 사구에 자생하는 식물에 존재하는 폴리페놀, 플라보노이드 함량과 항산화 활성 비교(Kim and Cha, 2017), 콩류의 이소플라본 함량과 항산화활성 및 혈전용해 활성 비교(Oh et al., 2002), 작물의 생장과 환경요인 상호간의 영향 평가(Lee et al., 2017; Nam et al., 2015) 비교 등의 통계분석 연구가 보고되었다. 한국산 초롱꽃과의 약리작용(Kim and Kang, 2017), 국내산 버섯의 영양성분 함량 및 항산화 활성(Lee et al., 2018), 국내 유통 가공식품에 함유된 영양소 성분(Yoon et al., 2017) 비교 등과 같은 대량의 특성 자료에 관한 데이터베이스가 구축에 관한 연구가 보고되었다. 통계 분석 자료를 기반으로 하여 데이터베이스를 구축하면 자원 특성에 관한 세밀한 분석이 가능하고 개별 분석 자료만으로는 어려운 종합적인 분석이 가능하다.

본 연구에서는 NIRS를 활용한 벼 유전자원에 대한 예측모델개발 및 대량평가체계 구축에 관한 선행연구(Oh et al., 2017a; Oh et al., 2017b)를 기반으로 농업유전자원센터에 보존되어있는 벼 유전자원에 대한 아밀로스 및 단백질에 대한 대량 평가를 실시하여 전반적인 함량 분포를 파악하고, 자원의 특성 및 보존 정보를 실시간으로 반영하여 수요자에게 제공할 수 있는 데이터베이스 시스템 구축을 기반으로 프로그래밍 개발을 위한 기초 자료로 활용하고자 하였다.

재료 및 방법

자원 선정 및 처리

본 실험에 사용한 국내외 벼 유전자원은 농업유전자원센터에서 보관 중인 전체 벼 자원을 대상으로 GMS 프로그램을 이용하여 분양 가능한 27,309자원을 선정하였으며, 재래종 4,948자원, 육성품종 6,157자원, 잡초형 6,206자원, 육성계통 9,998자원으로 구성되었다(Table 1). 자원 종자 50립을 실험실용 현미기로 탈영시킨 후 사미, 피해립을 제거하여 현미립을 준비하였다. 이후 분쇄기로 약 2분간 분쇄하여 균일한 현미가루 상태로 만든 후 NIRS를 이용하여 현미시료의 아밀로스함량과 단백질함량을 측정하였다. 수분함량 분석은 곡류 및 곡류제품-수분함량측정(산업통상자원부 국가기술표준원, 표준번호: KS H ISO 712)기준을 참조하여 130℃ 온도조건에서 수분측정기(Shimadzu, Japan)를 사용하여 시료의 수분을 측정하였고, 이들 준비된 현미시료들은 13℃ 저온저장고에 보관하여 수분함량 14% 이하 상태로 시험에 사용하였다.

Table 1. Origin distribution of rice germplasm used in the analysis of NIRS

Type Origin Number of accessions Ratio of accessions (%)
A (Landrace) Korea 1,232 24.90
North Korea 1,073 21.69
Japan 942 19.04
China 581 11.74
Philippines 177 3.58
Taiwan 169 3.42
Sierra Leone 116 2.34
unknown 353 7.13
the others 305 6.16
Total 4,948 100
B (Variety) China 1,542 25.04
Japan 1,409 22.88
Korea 413 6.71
India 287 4.66
Bangladesh 256 4.16
Philippines 246 4.00
Taiwan 122 1.98
unknown 404 6.56
the others 1,478 24.01
Total 6,157 100
C (Weed type) Korea 5,988 96.49
India 111 1.79
China 18 0.29
Indonesia 14 0.23
the others 75 1.20
Total 6,206 100
D (Breeding line) Korea 2,464 24.65
China 2,152 21.52
Japan 1,277 12.77
Philippines 1,238 12.38
Taiwan 239 2.39
India 183 1.83
Thailand 146 1.46
unknown 1,608 16.09
the others 691 6.91
Total 9,998 100

NIRS 검량식 작성 및 검증

벼 유전자원 511자원의 현미가루 상태에 대한 근적외선 스펙트럼을 측정하기 위해 근적외선 분광분석기(FOSS, XRD near-infrared)와 기기 구동을 위한 전용프로그램인 ISI scan (FOSS, ver. 4.2.0)을 사용하였으며, micro insert ring을 끼운 mini sample cup에 시료 약 0.6 g을 채운 후 sample cup backs를 이용하여 시료 내 공극을 없애준 후, 실온조건 가시광선 및 근적외선 대역(400-2500 ㎚)에서 한 자원 당 3반복 scanning하여 근적외선 스펙트럼을 얻었다. 이후 검량식 작성을 위하여 벼 유전자원 511자원 별 아밀로스함량 및 조단백질함량을 입력하여, 습식분석값이 저장된 근적외선 스펙트럼을 파일형태로 저장하였다. 습식분석값이 저장된 근적외선 스펙트럼은 WINISI Ⅲ project manager (FOSS, ver. 1.50e)의 standard normal variance와 detrend 기능을 이용한 시료 입도차이에서 발생하는 스펙트럼 산란현상 보정, 수학적 처리, 회귀분석과 같은 일련의 연속적 처리과정을 거쳐 검량식 작성에 사용되었다. 수학적 처리는 1,4,4,1 (1st derivative, 4 ㎚ gap, 4 point smooth, 1 point second smooth)을 사용하였으며, 회귀분석은 검량식 작성과 동시에 cross validation결과를 얻을 수 있는 modified partial least squares (MPLS)법을 사용하였다. 습식분석값과 NIRS 측정값의 통계적 해석과 상관관계분석은 WINISI Ⅲ project manager의 global equation 기능을 사용하여 예측모델을 개발하였으며, 개발된 예측모델 중 습식분석값을 가장 잘 예측할 수 있는 최적 예측모델은 RSQ (R2), Standard error of calibration (SEC), Standard error of prediction (SEP), Slope, Bias, Standard error of cross-validation (SECV) 및 One minus the ratio of unexplained variance to total variance (1-VR) 등의 통계치를 고려하여 선별하였다. 벼 유전자원의 이화학적 성분 분석용으로 개발된 최적 NIRS 예측모델의 미지시료 적용가능성을 검증하기 위해, 검량식 작성에 이용되지 않은 자원들의 아밀로스 및 단백질 농도를 NIRS를 이용하여 측정한 후 각 성분들의 함량을 저, 중, 고 함량 구간으로 나누고 각 구간별 함량을 대표하는 50자원을 선정하여 최종 아밀로스함량 검증용 150자원과 조단백질함량 검증용 150자원을 선별하였다. 이후, NIRS 스펙트럼 측정과 이화학적 성분 분석을 수행하여 validation file을 작성하였다. 작성된 validation file을 대상으로 WINISI Ⅲ project manager (FOSS, ver. 1.50e)의 monitor result 기능을 사용하여 계산된 Slope, RSQ, SEP, Bias 등의 통계치를 바탕으로 NIRS 예측모델의 미지시료 적용가능성과 정확성을 검증하였다.

NIRS를 이용한 아밀로스 및 단백질 함량 측정

현미가루 시료 약 600 ㎎을 micro insert ring을 끼운 mini sample cup에 채운 후 sample cup backs를 이용하여 시료 내 공극을 없애준 후 실온조건 가시광선 및 근적외선 대역(400-2500 ㎚)에서 한 자원 당 2반복하여 스펙트럼을 측정하였다. 스펙트럼 측정은 NIRS (FOSS, XRD near-infrared)를 사용하였고, 아밀로스 및 단백질 함량 계산은 개발된 NIRS 예측모델이 입력된 NIRS 구동 전용프로그램인 ISI scan (FOSS, ver. 4.2.0)을 사용하였다.

자원들의 다양성 지수 계산

다양성 지수는 자원 집단들 간의 차이를 나타내기 위한 수단이지만, 수치화된 지표가 없으므로 분자생물학분야에서 사용되는 유전적 다양성(polymorphism information content) 계산식을 적용하여 이를 다양성지수로 표시하고자 하였다. 집단을 구성하는 자원들의 함량 범위가 넓게 분포하는 경우에는 좁은 범위에 분포하는 것보다 높은 다양성 지수를 나타내게 된다. 벼 집단의 아밀로스와 단백질 함량구간을 2% 함량단위로 나누고 각 함량구간(i)에 속하는 자원수(ni)를 전체 자원수(N)로 나누어 다양성 확률값(Pi=niN)을 계산했다. 각 함량구간의 다양성 확률값을 제곱하고 모두 합산 후 1에서 뺀 값으로 다양성지수 VIV (Variability Index Value)를 구하였다. 집단 내 개체들의 특성을 표현하는 유전자는 2n 형태의 대립유전자로 존재한다. 유전적 다양성 계산에서는 대립유전자를 homogeneous type으로 가정하기 때문에 Pi2 값은 homogeneous type의 유전자가 발현될 확률을 의미하며, 이를 1에서 뺀 값은 heterogeneous type의 유전자가 발현될 확률이다. 따라서 다양성 지수가 1에 가까울수록 heterogeneous type의 유전자가 발현될 확률이 크다는 의미이므로 집단의 다양성은 커진다.

$$\mathrm{Variability}\;\mathrm{Index}\;\mathrm{Value}=1-\sum_{i=1}^kP_i^2$$

확률밀도함수 작성

히스토그램과 정규분포 작성 과정에 관한 이론적 배경을 Fig. 1과 같이 나타냈다. 연속 계급값을 x축에 이들의 확률값을 y축에 나타내어 확률분포 막대그래프로 나타낼 수 있다(Fig. 1A). 막대그래프의 y축에 표시된 확률값을 막대그래프의 면적으로 전환하기 위해서 계급폭으로 나누어 {P(X)/계급폭} 표시하고 확률값을 면적으로 환산된 확률밀도 히스토그램을 작성한다(Fig. 1B). 막대그래프로 표시된 히스토그램은 정규분포곡선으로의 변환과정을 거친다. 여기서 곡선 밖의 막대그래프 면적이 곡선과 막대그래프 사이의 비어 있는 부분의 면적과 같기 때문에 곡선 내부의 면적으로 환산처리 된다(Fig. 1C). 따라서 히스토그램과 정규분포곡선이 이루는 면적은 동일하게 된다(Fig. 1D). 히스토그램의 확률밀도분포가 정규분포를 따르면 임의의 확률변수 구간에 해당하는 확률값은 정규분포곡선이 이루는 면적값과 동일하므로 이를 이용하여 임의의 구간에 대한 확률값을 구할 수 있다. 히스토그램과 정규분포의 함량별 자원분포 유사성은 엑셀프로그램(Excel 2010)을 사용하여 그래프를 작성하여 확인할 수 있다(Fig. 1E). 히스토그램과 정규분포에 관한 이론을 바탕으로 벼 27,309 자원을 재래종, 육성품종, 잡초형, 육성계통으로 구분한 후 NIRS 측정결과로 얻어진 아밀로스 및 단백질 함량 자료를 도수분포표로 정리하였다. 계급폭(n, class width)을 아밀로스의 경우 1, 단백질은 0.25로 구분하여 확률밀도표시 히스토그램을 만들었다. 정규분포곡선은 전체 유전자원에 대한 성분 함량 각각의 평균값과 분산값을 구한 후 엑셀프로그램의 정규분포함수식(NORM.DIST)에 이들 값들을 입력하여 확률밀도함수 그래프를 그렸다.

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Fig. 1.

Relationship between probability density histogram and normal distribution.

정규분포의 표준화

정규분포 집단의 확률변수 X 값을 표준정규분포의 표준단위 Z 값으로 바꾸는 것을 표준화작업이라 한다. Z 값은 표본값(정규분포의 성분값)과 평균값과의 차이인 편차를 표준편차로 나눈 것으로 정의된다. 평균값(m)과 분산(σ2)을 가지는 정규분포를 표준화하게 되면 평균값 0, 분산 1인 표준정규분포로 변환된다. 정규분포상의 확률변수 X는 평균값(m)과 표준편차(σ)의 실수배(kn)의 합으로 표현될 수 있다(Fig. 2). Z 분포에서 평균값 0부터 표준단위 kn 값까지 확률변수 구간의 확률값을 표로 정리하여 나타낸 것을 표준정규분포표라 하고 이 확률값은 면적값과 동일하다. 정규분포의 평균과 표준편차만 알면 Z 분포에서 kn 값을 구한 후 표준정규분포표를 활용하여 임의의 확률변수 구간의 확률(면적)을 구할 수 있다. 이와 같이 Z 분포에서 구해진 확률값을 집단의 전체 개체수에 곱하여 특정 확률변수 구간을 이루는 개체수를 구하였다.

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Fig. 2.

The process and findings of standardization of normal distribution.

확률변수 X의 표준단위 Z 값으로의 변환과정에 관한 이론적인 배경을 아래 식과 Fig. 2로 나타냈다. 확률변수 X값으로 나타낸 평균 E(X)를 변형하면 E(aX+b)의 평균으로 표현된다. 이를 간단히 하면 aE(X)+b로 표현된다(Equation 1).

$$E(X)=\sum_{i=1}^nx_ip_i=m$$ $$E(aX+b)=\sum_{i=1}^n(ax_i+b)p_i=\sum_{i=1}^n(ax_ip_i+bp_i)$$$$=\sum_{i=1}^nax_ip_i+\sum_{i=1}^nbp_i=\overset n{\underset{i=1}{a\sum}}x_ip_i+b\sum_{i=1}^np_i$$ $$=\overset n{\underset{i=1}{a\sum}}x_ip_i+b=aE(X)+b$$ $$\therefore E(aX+b)=aE(X)+b$$ (Equation 1)

확률변수 X값으로 나타낸 분산 V(X)를 변형하면 V(aX+b)의 분산으로 표현된다. 이를 간단히 하면 a2V(X)로 표현된다(Equation 2).

$$E(aX+b)=aE(X)+b$$ $$V(X)=\sum_{i=1}^n\{x_i-E(X{)\}^2}p_i=\sigma^2$$ $$V(aX+b)=\sum_{i=1}^n\{(ax_i+b)-E(aX+b{)^2\}}p_i=\sum_{i=1}^n\lbrack ax_i+b-\{aE(X)+b{\}^2\rbrack}p_i$$ $$=\sum_{i=1}^n\{ax_i+b-aE(X)-b\}^2p_i=\sum_{i=1}^n\{ax_i-aE(X)\}^2p_i$$$$=\sum_{i=1}^n\lbrack a\{x_i-E(X){\}\rbrack^2}p_i=\sum_{i=1}^na^2\{x_i-E(X)\}^2p_i$$$$=a^2\sum_{i=1}^n\{x_i-E(X)\}^2p_i=a^2V(X)$$ $$\therefore V(aX+b)=a^2V(X)$$ (Equation 2)

*(참고) i=1n{xi-E(X)}2pi=제곱 =분산{V(X)}=σ2

위의 두식을 이용해서 표준화과정의 Z 값 변환 수식에 평균정리와 분산정리를 적용하면 Z 분포의 평균값(0), 분산(12)의 결과를 얻을 수 있다(Fig. 2).

표준화에 의한 Data 구간 산정

정규분포곡선 상의 임의의 확률변수 구간내의 확률(면적)은 표준화과정을 거쳐 구하였다. 구해진 확률값을 집단의 전체 자원수에 곱하여 확률변수 구간에 존재하는 자원수를 구하였다. 전체 자원수가 1,000자원, 아밀로스 함량 X1X2 구간 사이 확률값이 0.1, X2X3는 0.2라고 하면, 아밀로스 함량 X1X2 구간 내 존재하는 자원수는 100자원(1,000×0.1), X1X3 구간 내 존재하는 자원수는 300자원{1,000×(0.1+0.2)}임을 확인 할 수 있다(Fig. 3).

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Fig. 3.

Outputting number of accessions in random data range by standardization of normal distribution.

결과 및 고찰

NIRS 검량식 작성 및 검증

검량식 관련 주요 통계지표에는 RSQ (R2), 1-VR, SEC, SECV가 있다. RSQ는 NIRS 예측모델의 결정계수이고 1-VR은 교차검증 결정계수이다. 결정계수값이 1에 가까울수록 예측모델의 신뢰성은 높아진다. SEC는 검량식 표준오차이고 SECV는 교차검증 표준오차이다. 표준오차값이 0에 가까울수록 예측모델의 정확도는 높아진다. 작성된 검량식의 RSQ는 아밀로스에 있어 0.956이었고, 단백질은 0.982이었다. SEC는 아밀로스에 있어 1.159였고, 단백질은 0.164였다. 작성된 검량식의 정확도를 검증하기 위해 검량식 작성에 사용된 보존 자원을 사용하여 교차검증한 결과, 1-VR은 아밀로스에 있어 0.957이었고, 단백질은 0.981이었다. NIRS 분석방법은 습식분석에 비해 정확성은 낮기 때문에 검량식 자원들을 적정 농도 구간에서 균등한 자원 밀도를 나타내도록 구성하는 것이 중요하다(Kim et al., 2008a). 작성된 검량식이 의미 있는 결과를 나타냈으나 특정 아밀로스 함량 구간의(9.62-16.58%) 자원밀도가 낮은 결측 구간이 존재하기 때문에 미지시료 측정 시 저 밀도 구간에서 큰 분석오차가 발생할 가능성이 존재한다. 이러한 점을 보완하기 위해, 특정 아밀로스 함량 구간에 해당될 것으로 예상되는 200자원을 추가 습식분석한 결과, 26자원만이 원하는 구간에 포함되었다. 선정된 26자원의 NIRS 측정과 습식분석값을 기존 검량식 자원에 추가하여 아밀로스 결측 구간을 보완하였다. 이 후 아밀로스 Outlier (이상치) 시료들을 검량식 자원에서 제거하였고, 단백질은 추가 보완 없이 Outlier (이상치) 시료만을 검량식 자원에서 제거하여 NIRS 예측모델을 최적화하였다. 아밀로스 결측 구간 보완으로 최적화된 NIRS 검량식과 관련 통계수치들을 나타냈다(Fig. 4, Table 2).

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Fig. 4.

Correlation plots between NIRS data and amylose (A) and protein content (B) in the milled brown rice germplasm.

Table 2. External validation results of NIRS equation model for the amylose and protein content in the milled brown rice

Constituent External validation NIRS equation model
No. r2 SEP Slope No. R2 SEC Slope
Amylose 132 0.962 2.349 0.811 465 0.970 1.010 1.000
Protein 124 0.986 0.415 1.038 473 0.983 0.158 0.998

1-VR은 검량식 작성에 이미 이용된 자원을 재차 이용하여 정확도를 평가하는 역검정 방법이다. 간편하게 평가가 이뤄지는 장점이 있으나 1-VR 만으로는 개발된 NIRS 예측모델의 미지시료 분석 시 정확도를 평가하기에 부족하다(Bagchi et al., 2016). 따라서 검량식 작성에 사용된 자원 외의 별도자원들을 이용하여 NIRS 기기내의 external validation 프로그램을 이용한 외부검증과정을 거쳤다. 검량식 작성에 사용된 511자원 이외의 재래종 2,000자원을 최적 예측모델이 적용된 NIRS를 이용하여 아밀로스 및 단백질 함량을 분석하였다. NIRS로 분석된 자원들을 저, 중, 고 함량 세 구간으로 나누고 각 함량의 구간별 대표자원을 선택하는 방법으로 아밀로스는 132자원, 조단백질은 124자원을 선정하여 NIRS 예측모델 검증자원으로 사용하였다. 선정된 검증자원들의 습식분석값을 NIRS 구동 프로그램의 lab data 항목에 입력하여 external validation set을 구성하였고, 최적 NIRS 예측모델에 external validation set이 적용된 검정 결과를 확인하였다(Table 2). 아밀로스와 단백질의 RSQ (r2) 값은 각각 0.962, 0.986이었고, SEP 값은 각각 2.349, 0.415였다. 단백질 SEP 값이 아밀로스 SEP 값보다 작으므로 단백질 측정 정확도가 높았으며, 이는 아밀로스 SEP 0.882, 단백질 SEP 0.280 값으로 보고된 Hwang et al. (1994)의 결과와도 유사한 경향으로 나타났다. SEP 값이 아밀로스가 단백질에 비해 높게 나타나는 것은 현미에는 아밀로스와 관련이 적은 성분이 많이 존재하는 등 미강의 혼입 및 그 분산 상태가 백미에 비해 다르기 때문인 것으로 생각된다(Moon et al., 1994). 이상의 결과들을 종합해 볼 때 개발된 최적 NIRS 예측모델은 기존의 습식분석에 의한 성분 분석 결과와 높은 상관도를 가지며, 분석정확도 또한 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 개발된 NIRS 예측모델은 습식분석에 소요되는 시간과 경비를 절감하여 대량의 벼 유전자원에 대한 신속한 이화학적 특성 분석에 적용 가능할 것으로 사료된다.

벼 유전자원의 집단분석

1) 자원별 아밀로스 함량 분포

전체 벼 자원을 재래종, 육성품종, 잡초형, 육성계통으로 구분하여 아밀로스 함량별 확률분포와 정규분포를 구하고 상호 비교하여 그 특성과 자원별 분포 경향을 비교하였다(Fig. 5). 아밀로스 확률분포가 정규분포에서 벗어난 구간이 확인되었고, 이는 자원밀도가 매우 낮은 구간의 영향으로 판단되어 아밀로스 함량구간을 찰벼에 해당하는 저아밀로스(13% 미만 구간)와 메벼에 해당하는 고아밀로스(13% 이상 구간)로 나누어 각각의 확률분포와 정규분포를 구하였다. 육성계통을 제외한 재래종, 육성품종, 잡초형 자원들의 저아밀로스 함량분포는 평균값 8.7, 표준편차 1.4인 정규분포와 유사하였다(Fig. 5. A1, B1, C1). 재래종, 육성품종의 고아밀로스 함량분포는 유사하였고, 낮은 자원밀도 구간(13-20%)과 높은 자원밀도 구간(27% 이상)이 나타났다(Fig. 5. A2, B2). 이와 같이 육성품종 함량에 있어 자원밀도가 낮거나 높은 구간이 나타나는 것은 특정 아밀로스 함량을 선호하는 육종 방향이 반영된 결과로 판단된다(Fig. 5. B2). 잡초형의 고아밀로스 함량은 평균을 기준으로 오른쪽으로 상당부분 치우쳐 분포하였다(Fig. 5. C2). 육성계통의 고아밀로스 자원 분포는 29% 이상 함량구간을 제외하면 평균값 24.2, 표준편차 3.0인 정규분포와 유사하였다(Fig. 5. D2). 재래종, 육성품, 잡초형, 육성계통 자원들의 저아밀로스 다양성 지수(VIV)는 대략 0.62였으며, 비슷한 다양성 정도를 보였다. 재래종, 육성품, 육성계통 자원들의 고아밀로스 다양성 지수(VIV) 값은 대략 0.80으로 저아밀로스에 비해 비교적 큰 다양성을 나타냈다.

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Fig. 5.

Normal distribution and probability density of amylose content in landrace (A1, A2), rice variety (B1, B2), weed type (C1, C2) and breeding line (D1, D2) germplasm.

전체 벼 유전자원 27,309자원을 구성하는 재래종 4,948자원, 육성품종 6,157자원, 잡초형 6,206자원, 육성계통 9,998자원들을 아밀로스 함량 기준으로 5종류로 분류하였고, 각 분류별 자원비율을 나타냈다(Table 3). 재래종(landrace)은 high amylose에서 타 자원대비 낮은 자원 비율을 나타냈고, middle waxy, low amylose, middle amylose에서는 높은 자원비율을 나타냈다. 잡초형(weed type)은 low amylose에서 타 자원대비 낮은 자원비율을 나타냈다. 육성계통(breeding line)은 waxy, middle waxy, middle amylose에서 타 자원 대비 낮은 자원비율을 나타냈고, high amylose에서는 높은 자원비율을 나타냈다. 전체 벼 자원의 평균 자원비율은 high amylose 자원이 가장 높았고, waxy 자원이 가장 낮았다. 국립식량과학원의 아밀로스 함량별 벼 자원 분류 기준에 따르면 아밀로스함량 6% 이하 자원을 waxy, 6-9%는 middle waxy, 9-17%는 low amylose, 17-21%는 middle amylose, 21% 이상은 high amylose type으로 분류하였다(Jeong et al., 2013).

Table 3. Classification of rice germplasm according to amylose content by NIRS

Germplasm Rice type
Waxy (below 6%) Middle waxy (6-9%) Low amylose (9-17%) Middle amylose (17-21%) High amylose (over 21%)
Landrace 0.36z 7.88 7.14 31.06 53.56
Variety 0.31 5.80 5.51 26.62 61.77
Weed type 0.03 4.21 3.85 12.54 79.37
Breeding line 0.02 1.24 5.58 11.98 81.18
Average 0.18 4.78 5.52 20.55 68.97
zMean percent ratio of accessions.

2) 자원별 단백질 함량 분포

전체 벼 자원을 재래종, 육성품종, 잡초형, 육성계통으로 구분하여 단백질 함량별 확률분포와 정규분포를 구하고 상호 비교하여 그 특성과 자원별 분포 경향을 비교하였다(Fig. 6). 재래종, 육성품종, 육성계통 자원들 간의 함량 평균과 표준편차는 유사한 수치를 나타냈으나 확률밀도분포는 서로 다른 경향을 나타냈다. 재래종과 잡초형이 유사한 확률밀도분포를 나타냈고, 육성품종과 육성계통이 유사하였다. 육성품종과 육성계통의 함량분포는 평균 8.0%, 표준편차 1.3%인 정규분포와 유사하였다(Fig. 6B, D). 자원들의 VIV 값은 0.43에서 0.57사이의 값을 나타냈고, 이는 저아밀로스 다양성 지수(VIV)보다 낮은 수치였으며 아밀로스 자원에 비해 다양성 정도는 크지 않았다.

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Fig. 6.

Normal distribution and probability density of protein content in landrace (A), rice variety (B), weed type (C) and breeding line (D) germplasm.

재래종 자원

재래종 4,948자원 중 찰벼에 해당하는 아밀로스(함량 13% 미만) 자원은 688자원이었고, 임의로 정한 함량구간 내 자원수는 정규분포곡선의 표준화 과정을 거쳐 계산된 확률값(A)을 총 자원수에 곱하여 구하였다(Fig. 7). 평균 함량은 8.7%, 표준편차는 1.4%였고, 함량 8.4-10.4% 사이 자원비율은 47.0% 323자원, 6.4-7.4% 사이 자원비율은 12.6% 86자원, 6.4-8.74% 사이 자원비율은 45% 309자원이었다. 메벼에 해당하는 아밀로스(함량 13% 이상) 자원은 4,260자원이었고, 임의로 정한 함량구간 내 자원수는 정규분포곡선의 표준화 과정을 거쳐 계산된 확률값(A)을 총 자원수에 곱하여 구하였다(Fig. 8). 평균 함량은 22.3%, 표준편차는 3.0%였고, 함량 22.3-26.1% 사이 자원비율은 39.8% 1,695자원, 25.1-27.1% 사이 자원비율은 12.1% 515자원, 28.1% 이상 자원비율은 2.7% 115자원이었다. 재래종 4,948자원에 대하여 정규분포곡선의 표준화 과정을 거쳐 계산된 확률값(A)을 총자원수에 곱하여 임의로 정한 단백질 함량구간 내의 자원수를 구하였다(Fig. 9). 7-8% 함량구간에서 표준정규분포곡선과 일치하지 않은 부분이 나타났다. 이는 확률밀도함수의 전체 평균값과 표준편차를 정규분포 수식에 대입하여 그린 그래프와 확률밀도함수와의 차이이며 이론적인 함수와 실질적인 조사수치와의 차이이다. 수집된 자원 수가 많이 있어 정규분포를 따를 것이라고 생각할 수 있지만 이론적인 함수와는 차이가 있을 수 있음을 보였다. 평균 함량은 8.2%, 표준편차는 1.3%였고, 함량 5.3% 이하 자원비율은 1.3% 64자원, 6.3-7.3% 사이 자원비율은 17.3% 856자원, 7.3-8.2% 사이 자원비율은 25.5% 1,262자원이었다.

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Fig. 7.

Number of accessions obtained from the probability density using the process of standard normal distribution of waxy type amylose content in landrace (n=688).

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Fig. 8.

Number of accessions obtained from the probability density using the process of standard normal distribution of common rice amylose content in landrace (n=4,260).

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Fig. 9.

Number of accessions obtained from the probability density using the process of standard normal distribution of protein content in landrace (n=4,948).

육성품종 자원

육성품종 6,157자원 중 찰벼에 해당하는 아밀로스(함량 13% 미만) 자원은 617자원이었고, 임의로 정한 함량구간 내 자원수는 정규분포곡선의 표준화 과정을 거쳐 계산된 확률값(A)을 총 자원수에 곱하여 구하였다(Fig. 10). 평균 함량은 8.7%, 표준편차는 1.4%였고, 함량 8.7-9.4% 사이 자원비율은 19.20% 118자원, 9.9-10.5% 사이 자원비율은 8.7% 53자원, 11.6% 이상 자원비율은 2.1% 13자원이었다. 메벼에 해당하는 아밀로스(함량 13% 이상) 자원은 5,540자원이었고, 임의로 정한 함량구간 내 자원수는 정규분포곡선의 표준화 과정을 거쳐 계산된 확률값(A)을 총 자원수에 곱하여 구하였다(Fig. 11). 평균 함량은 22.3%, 표준편차는 2.9%였고, 함량 22.1-23.6% 사이 자원비율은 20.9% 1,157자원, 20.1-20.6% 사이 자원비율은 4.8% 265자원, 20.1-22.7% 사이 자원비율은 31.9% 1,767자원이었다. 육성품종 6,157자원에 대하여 정규분포곡선의 표준화 과정을 거쳐 계산된 확률값(A)을 총자원수에 곱하여 임의로 정한 단백질 함량구간 내의 자원수를 구하였다(Fig. 12). 7-8% 함량구간이 표준정규분포곡선과 다소 일치하지 않는 부분으로 나타났다. 평균 함량은 8.0%, 표준편차는 1.3%였고, 함량 8.8-9.4% 사이 자원비율은 11.5% 708자원, 6.1-8.3% 사이 자원비율은 51.1% 3,146자원, 6.6-8.0% 사이 자원비율은 35.1% 2,161자원이었다.

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Fig. 10.

Number of accessions obtained from the probability density using the process of standard normal distribution of waxy type amylose content in rice variety (n=617).

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Fig. 11.

Number of accessions obtained from the probability density using the process of standard normal distribution of common rice amylose content in rice variety (n=5,540).

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Fig. 12.

Number of accessions obtained from the probability density using the process of standard normal distribution of protein content in rice variety (n=6,157).

잡초형 자원

잡초형 6,206자원 중 찰벼에 해당하는 아밀로스(함량 13% 미만) 자원은 418자원이었고, 임의로 정한 함량구간 내 자원수는 정규분포곡선의 표준화 과정을 거쳐 계산된 확률값(A)을 총 자원수에 곱하여 구하였다(Fig. 13). 평균 함량은 8.7%, 표준편차는 1.4%였고, 함량 9.7-10.7% 사이 자원비율은 15.2% 63자원, 6.9-9.7% 사이 자원비율은 66.5% 278자원, 7.9-8.7% 이상 자원비율은 22.6% 94자원이었다. 메벼에 해당하는 아밀로스(함량 13% 이상) 자원은 5,788자원이었고, 임의로 정한 함량구간 내 자원수는 정규분포곡선의 표준화 과정을 거쳐 계산된 확률값(A)을 총 자원수에 곱하여 구하였다(Fig. 14). 평균 함량은 23.6%, 표준편차는 2.4%였고, 함량 23.6-24.8% 사이 자원비율은 19.2% 1,111자원, 25.7-26.6% 사이 자원비율은 8.7% 503자원, 28.5% 이상 자원비율은 2.1% 121자원이었다. 잡초형 6,206자원에 대하여 정규분포곡선의 표준화 과정을 거쳐 계산된 확률값(A)을 총자원수에 곱하여 임의로 정한 단백질 함량구간 내의 자원수를 구하였다(Fig. 15). 7-8% 함량구간이 표준정규분포곡선과 다소 일치하지 않는 부분으로 나타났다. 평균 함량은 7.9%, 표준편차는 0.9%였고, 함량 5.6% 이하 자원비율은 0.6% 37자원, 7.4-7.6% 사이 자원비율은 8.1% 502자원, 7.0-7.9% 사이 자원비율은 33.2% 2,060자원이었다.

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Fig. 13.

Number of accessions obtained from the probability density using the process of standard normal distribution of waxy type amylose content in weed type (n=418).

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Fig. 14.

Number of accessions obtained from the probability density using the process of standard normal distribution of common rice amylose content in weed type (n=5,788).

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Fig. 15.

Number of accessions obtained from the probability density using the process of standard normal distribution of protein content in weed type (n=6,206).

육성계통 자원

육성계통 9,998자원 중 찰벼에 해당하는 아밀로스(함량 13% 미만) 자원은 596자원이었고, 정규분포곡선의 표준화 과정을 거쳐 계산된 확률값(A)을 총자원수에 곱하여 임의로 정한 함량구간 내의 자원수를 구하였다(Fig. 16). 평균 함량은 10.3%였고, 함량 10.0-12.0%사이의 자원비율은 47.0% 280자원, 8.0-9.0% 사이의 자원비율은 12.6% 75자원, 8.0-10.3% 사이의 자원비율은 45% 268자원이었다. 메벼에 해당하는 아밀로스(함량 13% 이상) 자원은 9,402자원이었고, 정규분포곡선의 표준화 과정을 거쳐 계산된 확률값(A)을 총자원수에 곱하여 임의로 정한 함량구간 내의 자원수를 구하였다(Fig. 17). 26% 이상 함량구간을 제외하면 아밀로스 자원 분포는 평균값 24.2, 표준편차 3.0인 정규분포와 유사하였다. 평균 함량은 24.2%였고, 함량 24.2-28.0%사이의 자원비율은 39.8% 3,741자원, 27.0-29.0% 사이의 자원비율은 12.1% 1,137자원, 30% 이상 자원비율은 2.74% 253자원이었다. 육성계통 9,998자원에 대하여 정규분포곡선의 표준화 과정을 거쳐 계산된 확률값(A)을 총자원수에 곱하여 임의로 정한 단백질 함량구간 내의 자원수를 구하였다(Fig. 18). 6.5-8% 함량구간이 다소 표준정규분포곡선과 일치하지 않은 부분을 나타냈다. 평균 함량은 7.9%였고, 함량 5% 이하의 자원비율은 1.3% 129자원, 6.0-7.0% 사이의 자원비율은 17.3% 1,729자원, 7.0-7.9% 사이의 자원비율은 25.5% 2,549자원이었다.

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Fig. 16.

Number of accessions obtained from the probability density using the process of standard normal distribution of waxy type amylose content in breeding line (n=596).

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Fig. 17.

Number of accessions obtained from the probability density using the process of standard normal distribution of common rice amylose content in breeding line (n=9,402).

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Fig. 18.

Number of accessions obtained from the probability density using the process of standard normal distribution of protein content in breeding line (n=9,998).

자원 정보구축에 관한 고찰

NIRS로 측정된 자원들의 함량 분포그래프와 함수를 이용한 정규분포를 비교한 결과 완전히 일치하지는 않지만 상호 유사도가 매우 높아 통계적 분석이 가능할 것으로 판단되었다. 벼 유전자원은 약 3만 자원으로 전체 자원을 하나의 자료형식으로 볼 수 없으므로 통계적 표현이 필요하였고, 아밀로스, 단백질 성분을 기반으로 전체자원의 분포를 파악할 수 있었다. 이들 자원에 대한 실시간 정보제공은 프로그래밍을 통해 이루어져야할 것으로 사료된다. 따라서 통계적 절차에 의한 분석정보 결과는 computer programming software를 개발하는데 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

적요

본 연구는 선행연구에서 개발된 근적외선 분광법(NIRS) 예측모델을 활용하여 농업유전자원센터에서 보존 중인 국내외 벼 유전자원의 아밀로스 및 단백질 함량 자료를 통계 처리하여 자원 분포를 파악하기 위한 데이터베이스를 구축하고자 하였다. 예측모델의 R2 값은 아밀로스 분석결과 0.970이었고, 단백질은 0.983이었다. 미지시료 측정 시 정확도를 평가하기 위해 외부 검정과정을 거친 결과 R2 값은 아밀로스 분석결과 0.962였고, 단백질은 0.986이었다. 벼 자원을 재래종, 육성품종, 잡초형, 육성계통으로 나누어 NIRS를 이용하여 성분 분석한 후 함량분포를 확인하였다. 찰벼 평균 아밀로스는 재래종, 육성품종, 잡초형에서 동일하게 8.7%였고, 육성계통은 10.3%였다. 메벼 평균 아밀로스는 재래종 22.3%, 육성품종 22.7%, 잡초형 23.6%, 육성계통 24.2%였다. 전체 벼 자원 중 아밀로스 함량 9%이하 waxy type은 5.0%, low amylose는 5.5%, middle amylose는 20.5%, high amylose는 69.0%를 차지하였다. 단백질 분석 결과 평균함량은 재래종 8.2%, 육성품종 8.0%, 잡초형 7.9%, 육성계통 7.9%였다. 찰벼의 다양성지수 평균은 0.62, 메벼는 0.80이었고, 단백질 다양성지수는 평균 0.51이었다. 임의의 함량구간 내 자원비율은 정규분포의 표준화과정을 통해 확인하였다. 임의 구간에 대한 자원분포비율 산출 결과는, 재래종 아밀로스 6.4-8.7% 구간의 자원비율은 0.45였고, 22.3-26.1% 구간은 0.40, 단백질 7.3-8.2% 구간은 0.26이었다. 육성품종 아밀로스 8.7-9.4% 구간의 자원비율은 0.19였고, 20.1-22.7% 구간은 0.32, 단백질 6.1-8.3% 구간은 0.51이었다. 잡초형 아밀로스 6.6-9.7% 구간은 0.67이었고, 23.6-24.8% 구간은 0.19, 단백질 7.0-7.9% 구간은 0.33이었다. 육성계통 아밀로스 10.0-12.0% 구간의 자원비율은 0.47이었고, 24.2-28.0% 구간은 0.40, 단백질 7.0-7.9% 구간은 0.26이었다. 어떤 임의 구간을 지정하여도 자원의 비율을 쉽게 구할 수 있으며, NIRS 분석과 통계분석과정을 통해 얻어진 자원별, 성분함량별 특성 자료는 효율적인 자원관리를 위한 데이터베이스 시스템 구축을 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

Acknowledgements

본 연구는 농촌진흥청 농업과학기술연구 개발사업(과제번호: PJ01353904)의 지원에 의해 이루어졌습니다.

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