서언
지속적인 스트레스는 기억, 인지, 감각, 운동을 담당하는 뇌부위인 해마에 손상을 입혀서 기억장해 증상을 수반하는 알츠하이머 질환이 발생된다. 이 질환의 발생은 주로 amyloid β설과 콜린효능설에 기반하여 일어난다고 인식되고 있다. 전자는 산화적 스트레스의 지속에 따라 amyloid β의 축적의 결과 신경세포 독성이 일어나는 과정이다(Han et al., 2010). 후자는 뇌의 acetylcholinesterase (AChE)의 활성증가에 따라 기억을 담당하는 acetylcholine이 감소하게 된 결과 일어나는 기억장해 질환이다(Georgiev et al., 2011).
현재 AChE의 감소를 일으키는 기전을 가지는 donepezil, rivastigmine, gallantamine과 같은 약물이 개발되어 알츠하이머 질환 치료약이 되고 있다(Lai et al., 2016). 또 천연물을 이용하여 AChE 억제제를 탐색하여 알츠하이머 질환을 치료하려는 노력도 수행되고 있다. 저자들도 이러한 연구를 수행하여 특히 일부 국화과 식물의 추출물과 성분들이 그러한 효과를 나타내고 있음을 보고해 왔다(Choi et al., 2017).
한편, 신체에서 발생될 수 있는 활성질소종의 하나인 peroxynitrite ion (ONOO-)도 신체조직의 단백질, 핵산, 인지질 등과 결합하여 독성을 나타낸다고 한다. Nitric oxide(NO)는 신체에서 신호전달을 위해 필요한 매개체이지만 이것은 염증을 일으킬 수 있다. NO가 과다하게 생산될 때는 superoxide anion radical과 결합하여 neuropathy, retinopathy, nephropathy와 같은 증상을 일으킬 수 있다(Patcher et al., 2005). 나아가서 peroxynitrite의 과다생산은 알츠하이머 질환의 또 다른 원인이 될 수 있다고 한다(Choi et al., 2016; Han et al., 2010).
단풍취(Ainsliaea acerifolia, Compositae)는 한국에서 자생하는 국화과 식물의 산야초이다. 이 식물은 숲속 그늘에서 자라는 국화과의 다년생 초본식물이다. 높이는 35-80cm에 달하며 7-9월에 흰꽃이 피는 이 식물의 어린 순을 나물로 먹는다. 이 식물은 중풍, 동맥경화, 고혈압, 숙취해소, 피로회복 등의 목적으로 한국사회에서 이용되고 있다(Kim, 1996). 산나물류에 포함된 caffeoylquinic acid에 속하는 화합물 중에서 알츠하이머 질환에 유효할 것이라는 보고가 나오고 있다(Han et al., 2010; Kwon et al., 2010). 본 연구에서는 이 식물의 aq. MeOH 추출물이 peroxynitrite 감소효과와 AChE 활성 저해작용을 나타냈으므로 caffeoylquinic acid에 속하는 화합물을 분석하고자 하였다.
재료 및 방법
기기 및 시약
HPLC system으로서 두 개의 Prostar 210 pump, Prostar UV-vis detector, 그리고 Shiseido (Tokyo, Japan) Capcell C18 column (5 ㎛, 4.6 x 25 ㎜)으로 구성되었다. 이동상 용매인 MeOH과 H2O는 J. T. Baker사(Phillisberg, NJ, USA)의 제품으로서 HPLC 급 시약을 사용하였다. HPLC data는 Varian Star Workstation 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 지표물질 caffeoylquinic acid 4종인 3-caffoylquinic acid, 5-caffoylquinic acid, 3,4- dicaffoylquinic acid, 3,5-dicaffoylquinic acid은 본 실험실에서 보관 중인 시료를 사용하였다. 그리고, caffeic acid는 Sigma사(St Louis, MO, USA) 제품을 사용하였고, 이의 메틸에스터인 caffeic acid methyl ester는 합성하여 사용하였는데 그 과정은 생략한다. 분석실험에 사용된 이러한 6종 화합물의 구조는 Fig. 1에 나타내었다. Peroxynitrite 소거활성을 위해 사용한 시약인 diethylenetriaminepentaacetic acid (Sigma Chemical Co., Louis, MO, USA), dihydrorhodamine 123 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), ONOO-(Cayman Chemicals Co., Ann Arbor, MI, US은 각 해당회사에서 구입하여 사용하였다.
식물재료
단풍취(A. acerifolia, Compositae)는 2018년 8월 강원도 대관령에서 채집한 후 잎과 줄기의 부위를 구별하여 건조한 후 세절하여 사용하였다. 이 식물은 상지대학교 산림과학과 송병민 교수가 동정하였다. 이 식물의 표본(natchem# 81)은 현재 상지대학교 제약공학과 천연물화학 실험실에 보관 중이다.
추출
식물재료 잎과 줄기를 따로 10.0 g씩 80% MeOH 250 mL에 넣은 후 60℃ 온도에서 5시간동안 초음파추출하였다. 이를 여과한 후 감압농축한 후 동결건조하여 단풍취 aq. MeOH extract로서 잎 추출물 0.57 g과 0.23 g을 각각 얻었다.
HPLC 분석법
두 용액 0.05% acetic acid가 함유된 H2O (v/v)와 0.05%가 함유된 acetic acid CH3CN (v/v)를 HPLC 분석을 위한 이동상으로 사용하였다. 전자를 Solvent A로 하고 후자를 Solvent B로 하였다. 용리과정은 다음과 같은 linear gradient elution 방식으로 프로그램화하여 수행하였다. 기울기 용리는 0-35 min (15→65% B), 35-40 min (65% B), 40-42 min (65→100% B), 42-46 min (100% B), 46-49 min (100→15% B)로 프로그램된 방법을 사용하였다.
6종 시료의 표준용액에 대해 검량선 작성을 위한 실험을 하여 직선성을 확인하였다. x 축은 농도인 ㎍/mL로 하였으며 y 축은 피크 면적을 나타내었다. 그 결과 검량선은 y = 169.94x + 77.29 (3-caffeoylquinic acid), y = 256.04x + 56.82 (Caffeic acid), y = 167.07x + 67.55 (5-caffeoylquinic acid), y = 159.35x + 68.66 (3,5-dicaffeoylquinic acid), y = 136.99x + 60.29 (3,4-dicaffeoylquinic acid), y = 176.33x + 59.83 (Caffeic acid methyl ester)을 확립하여 함량계산에 이용하였다. 이렇게 작성된 검량선은 3.13 – 100.0 ㎍/mL 농도에서 그 R2 값이 0.997 이상임을 확인하였다. 그리고, 흐름속도는 1.0 mL/min로 하였고 컬럼 온도는 40℃로 하였다. 검출을 위한 자외선 파장은 254 ㎚였으며, 각 시료당 40분간 모니터링하였다.
AChE 활성의 결정
AChE의 활성은 Ellman et al. (1961)의 방법을 약간 변경하여 측정하였다. 이 활성 측정을 위한 기질로 ACh를 사용하였다. 100 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) 140 μL, 시료 20 μL, AChE (0.36 U) 20 μL를 각각 96 well plate에 넣고 실온에서 15분간 인큐베이션하였다. 그 후 DTNB[5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)]와 기질 ACh 10μL를 넣어서 반응액이 200 μL가 되도록 맞추어서 96 well plate에 넣었다. 이 때 DTNB가 ACh를 분해하여 생성된 thiocholine의 반응에 따라 생성된 5-thio-2-nitrobenzoate anion을 15분 후에 412 ㎚ 파장에서 microplate reader VERSAmax (Molecular Devices, CA, USA)로 측정하였다. 억제율(%) = [1 –(Asamp/Acon) /Astd] × 100의 식을 이용하여 계산하였다.
Peroxynitrite 소거활성의 결정
Kooy et al. (1994)의 방법에 따라 peroxynitrite 소거활성을 측정하였다. DHR 123이 peroxynitrite의 작용에 따라 생성되는 rhodamine 123의 형광을 측정함으로써 그 소거활성을 평가하였다. 즉, Rhodamine buffer solution (pH 7.4)은 50 mM sodium phosphate dibasic, 50 mM sodium phosphate monobasic, 90 mM sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 그리고 100 μM DTPA로 제조된 것이다. DHR 123의 최종농도를 5 μM로 하였다. 이 실험에서 완충용액은 사용시에 제조하여 빙수에 보관하면서 사용하였다. 0.3 M peroxynitrite의 존재 하에서나 부존재 하에서 측정하였다. Microplate fluorescence reader FL 500 (Bio-tek Instruments Inc., Winooki, VT, USA)을 이용하여 각각 480 ㎚와 530 ㎚의 excitation 및 emission 파장에서 측정하였다. 최종형광에서 배경형광을 빼주어서 peroxynitrite 소거활성을 결정하였고, 그 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 양성대조군으로는 L-penicillamine을 사용하였다.
결과 및 고찰
단풍취 aq. MeOH 추출물은 AChE 활성을 억제하였고, peroxynitrite 소거활성이 나타났다. Table 1에 나타내었듯이, AChE에 대한 억제활성으로 그 IC50가 73.4 μg/ml로 계산되었고 peroxynitrite 소거활성의 IC50는 8.60 μg/ml로 계산되었다. 그리고, 단풍취에 가장 많이 함유된 것으로 예상된 3,5-dicaffeoylquinic acid의 활성으로 AChE에 대한 억제효과로서 그 IC50가 69.19 μg/ml이었고 peroxynitrite 소거에 관한 IC50는 3.79 μg/ml로 나타나 이 화합물의 활성은 단풍취 추출물의 효과와 유사하게 나타났다.
Table 1. IC50 values (㎍/mL) of A. acerifolia extract and 3,5-dicaffeoylquinic acid on peroxynitrite and AChE
| Treatment | Peroxynitrite | AChE |
| A. acerifolia aq. extract | 10.55 ± 0.277z | 73.4 ± 1.01 |
| 3,5-Dicaffeoylquinic acid | 3.79 ± 0.250 | 69.19 ± 1.27 |
| L-Penicillamine | 0.845 ± 0.353 | - |
| Berberine | - y | 0.177 ± 0.310 |
한편 caffeoylquinic acid에 속하는 화합물 중 chlorogenic acid와 3,5-dicaffeoylquinic acid가 알츠하이머질환에 유효할 것이라는 보고가 있다(Han et al., 2010; Kwon et al., 2010). Chlorogenic acid는 해마와 frontal cortex에서 AChE와 지질과산화를 억제하여 알츠하이머 질환에 유효할 것이라고 보고되었다(Kwon et al., 2010). 또 3,5-dicaffeoylquinic acid가 amyloid β로 유도한 SH-SY5Y 세포의 손상을 억제하였으므로 이 화합물은 알츠하이머 질환에 유효할 것으로 보고되었다(Han et al., 2010).
본 실험에서는 caffeoylquinic acid에 속하는 3-caffoylquinic acid, 5-caffoylquinic acid, 3,4-dicaffoylquinic acid, 3,5- dicaffoylquinic acid 외에도 caffeic acid 및 caffeic acid methyl ester를 지표물질로 하여 HPLC의 방법으로 단풍취 추출물로부터 분석하고자 하였다. 5종의 표준 화합물 혼합물과 추출물의 HPLC chromatogram을 Fig. 2에 나타내었다.
6종 화합물의 retention time은 5.02분(3-caffeoylquinic acid), 6.17분(caffeic acid), 8.22분(5-caffeoylquinic acid), 10.62분(3,5- dicaffeoylquinic acid), 11.44분(3,4-dicaffeoylquinic acid), 13.65분(caffeic acid methyl ester)에서 각각 나타났다. 각 화합물의 검량선은 실험항에 나타내었고, 이들은 직선범위 3.13 – 100.0 μg/ml에서 그 R2 값이 모두 0.997 이상이었으므로 이들 6종 화합물의 직선성이 확인되었다. 6종 화합물의 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 각각 0.23 μg/ml, 0.75 μg/ml 이하로 나타났으므로 검출과 정량을 위한 감도는 높음을 알 수 있었다.
이러한 분석법을 확립한 후 HPLC 측정에 따른 단풍취 추출물 중 함량을 계산한 결과를 Table 2에 나타내었다. 여기에 잎과 줄기에 대한 결과, 그리고 추출물 중 함량 및 식물 건조물당 함량을 각기 나타내었을 뿐 아니라 함량의 합계도 나타내었다. 먼저 추출물 중 총함량으로 잎의 경우 25.1%의 매우 높은 함량을 보였으며, 줄기에서는 8.10%의 함량을 보여 줄기에서는 상대적으로 그 함량이 낮음을 알 수 있다. 잎 추출물 중 개별 화합물의 함량을 살펴보면 3,5-dicaffeoylquinic acid가 145.6 ㎎/g의 값을 보여 그 함량이 가장 높았다. 더욱이 caffeic acid는 이 HPLC chromatogram에서 나타나지 않으므로 caffeic acid는 주로 quinic acid와 결합한 채로 존재함을 알 수 있다. 또, Han et al.(2010)도 3,5-dicaffeoylquinic acid 가 알츠하이머 질환에 유효할 것이라고 보고한 바 있기 때문에 단풍취 추출물은 이것의 높은 함량에 따라 알츠하이머 질환에 유효할 것으로 예상된다.
Table 2. Content of compounds in the extracts (80% MeOH) and dried plant materials of A. acerifolia (㎎/g)
적요
국화과에 속하는 단풍취의 추출물이 가지는 알츠하이머에 대한 효과를 알기 위하여 AChE에 대한 억제효과와 peroxynitrite 소거효과를 연구하였다. 단풍취 추출물은 AChE에 대한 억제효과로서 그 IC50가 73.4 μg/ml이었으며 peroxynitrite 소거효과에 관한 IC50는 8.60 μg/mL이었으므로 알츠하이머 질환에 유익할 것으로 판단된다. 단풍취에 가장 많이 함유된 성분인 3,5-dicaffeoylquinic acid 성분의 활성도 이와 유사한 활성을 보였으므로 단풍취 추출물의 효과는 주로 이 화합물의 활성에 따른 것으로 예상된다. Caffeoylquinic acid가 알츠하이머 질환에 효과있다는 보고가 있으므로 이 식물의 잎과 줄기 추출물에서 6종의 지표물질을 이용하여 정량법을 확립한 후 정량하였다. 그 결과 잎에서는 성분 함량이 25.1%를 차지하여 줄기의 함량보다 훨씬 높았다. 특히 잎 추출물 중 3,5-dicaffeoylquinic acid의 함량이 145.6 ㎎/g에 달하여 알츠하이머 질환 치료에 유익할 것으로 예상된다.
